Expérience à Orsay

Journée d'expérience à Orsay

Le 3 décembre 2013

Laboratoire de Physique des Solides

 

 

Au début de notre TPE, nous sommes entrées en contact avec une enseignante-chercheuse de physique à la Faculté d'Orsay et elle étudie la morphogénèse des Biofilms. Elle nous a invité à venir une journée dans son laboratoire pour étudier "Comment se forme les Biofilms ?" avec différentes conditions expérimentales.

 

3.1.Expérience : "Comment se forme un Biofilm ?"

 

On a fait une culture de Bacillus Subtilis en milieu semi-solide avec comme gélose du Luria Broth en poudre (milieu nutritif composé de d'extraits de levure, minéraux, magnésium) plus de l'agar-agar en poudre, le tout dissous dans l'eau et mis dans une boite de Pétri pendant 15 heures dans une autoclave à 37°C, la gélose est formée.

On prélève une colonie de bactérie de Bacillus Subtilis pour la mettre dans du LB (Luria Broth) liquide à 37°C dans l’incubateur pour après la mettre dans un agitateur à 240 rpm (rotation par minute). 

3.2.Bacillus Subtilis :

C’est une bactérie aérobie stricte, c’est-à-dire, qu’elle a besoin d’oxygène pour survivre. Elle est en forme de bâtonnets et elle est  motile dans les liquides grâce à ses flagelles qui recouvrent toute sa surface. Cette bactérie est capable de former des Biofilms entre un liquide et l’air.

La souche Bacillus Subtilis utilisée est la suivante : GFP-B5B168 (protéine fluorescente-nom de la bactérie).

La GFP (green fluorescent protein) est une protéine ayant pour propriété d’émettre une fluorescence de couleur verte, issue de la méduse « Aequorea victoria ». On pourra par la suite observer les bactéries Bacillus Subtilis au microscope à fluorescence par exemple.

3.3.Densité optique :

On mesure la densité optique avec un spectrophotomètre qui sert à calculer l’absorbance (Loi de Beer-Lambert) en densité optique.

Pour calculer l’absorbance à l’aide du spectrophotomètre, on met d’abord un blanc (échantillon qui contient de l’eau distillé) et après l’échantillon contenant la solution de bactéries. Après chaque mesure on remet les tubes dans l’agitateur à 30°C.

Croissance de la population des Bacillus Subtilis :

11h à D.O. = 0 abs
12h à D.O. = 0.002 abs
14h20 à D.O. = 0.042 abs
15h20 à D.O. = 0.28 abs

Reconcentration des bactéries pour la formation du Biofilm :

On prélève la solution de bactéries à l’aide d’une micropipette qu’on transfert dans trois petits tubes (1,5mL/tube) qu’on met dans une centrifugeuse (10 000/min pendant 5min). Après les bactéries se précipitent dans le fond des tubes, on prélève l’agent en faisant attention à ne pas aspirer le culot de bactéries. Ensuite on ajoute de l’eau dans chaque tube, en l’aspirant et la réinjectant plusieurs fois pour après reconcentrer les trois tubes en un seul. Le tube contenant toutes les bactéries repasse à la centrifugeuse, ajout du motility buffer, suspension de la solution.

Les conditions de formation du Biofilm :

Dans une première boite de Pétri, on met un milieu liquide minimal composé de manganèse et glycérol (source de carbone) – GM.

Une deuxième boîte, on met un milieu riche de LB mais pas suffisant pour le développement du Biofilm.

Une troisième boîte, on met un mélange de LB + Manganèse + Glycérol (LBGM).

Pour la formation du Biofilm, on a préférer mettre les boîtes de Pétri dans une salle où il fait sombre

car on avait utilisé une plaque à rayons U.V. pour exciter la protéine fluorescente de la bactérie. Cette salle était à une température ambiante de 23°C et on a laissé les Biofilms prendre forme pendant quatre jours.

Observation des Biofilms après quatre jours :

On a observer dans la première boîte où il y avait du milieu minimal que le Biofilm ne s’était pas former, il y avait que du liquide contenant les bactéries Bacillus Subtilis.

Les bactéries dans le milieu de LB (riche mais pas suffisant) ont commencé à former un Biofilm mais il ne s’est pas totalement développé.

On observe un Biofilm formé par les bactéries dans un milieu de LB + Manganèse + Glycérol, celui-ci à formé des rides très marquées dues à l’élasticité, flambage (terme scientifique).

Observation au Microscope Confocal :

Le Microscope Confocal est un microscope optique inversé c'est-à-dire que l’échantillon est placé sur l’objectif donc on obtient des images commençant par le dessous de la boîte. Les images obtenues sont en trois dimensions (tridimensionnelles) qui permettent une reconstruction des volumes mais aussi elles peuvent observées en direct. Il fonctionne en lumière réfléchie ou en fluorescence. La plupart du temps, on utilise un laser comme source de lumière, on parle alors de microscope confocal à balayage laser. La microscopie confocale permet des études sur du matériel fixé, mais permet également d'étudier des phénomènes dynamiques, sur des cellules ou des tissus vivants, en particulier grâce aux molécules de la GFP (Green Fluorescent Protein) une bactérie forme un minuscule bâtonnet.

Pour regarder les Biofilms au microscope confocal, il a fallu aspirer minutieusement le liquide qui était en dessous, sans l’abimer. Le Biofilm est fin et rugueux, il à une épaisseur de 300µm (micromètres) donc il est très fragile !                   

L’image du Biofilm au microscope est de couleur verte fluorescente de par la protéine (GFP), à l’observation on a une impression de relief due à la matrice extracellulaire sécrétée par les bactéries avant la formation du Biofilm (quorum sensing).  Quand on a zoomé sur une partie de la matrice extracellulaire, nous avons observé la structure microscopique et constaté que les bactéries sont alignées et forment des faisceaux, chaînettes ou encore des fibres. A l’unité, une bactérie forme un minuscule bâtonnet.

Notre journée s’est terminée sur l’observation des Biofilms au microscope. 

Conclusion de la journée :

Nous avons appris que de connaître les conditions expérimentales de formations du Biofilm étaient importantes pour savoir comment il se forme : Quels milieux ? ; Quelles températures ?  Etc.

Quand nous avons quitté les biofilms, ils n’étaient pas formés mais quatre jours plus-tard certains ne s’étaient pas formés, d’autres à moitié ou en entier avec des « rides ». Nous avons eu la chance de découvrir des images tridimensionnelle (en 3D) du biofilm à l’aide du microscope confocal, qui est une première au laboratoire d’Orsay. Ca été une expérience très enrichissante personnellement et scolairement, unique, qui restera gravé dans nos mémoires. Nous avons appris beaucoup de choses sur le Biofilm pour notre TPE.